Wie liest man ein Chromatogramm?

Das Chromatogramm ist das Herzstück vieler Analysenzertifikate. Aus ihm wird die Reinheitsangabe in Prozent berechnet. Wer die Grafik lesen kann, versteht, woher die Zahl kommt und wo ihre Grenzen liegen. Grundlagen zu HPLC und Massenspektrometrie erklärt der Artikel Peptid-Reinheit: HPLC, MS und COA.

Was die Achsen zeigen

Die x-Achse zeigt die Zeit in Minuten seit der Injektion. Die y-Achse zeigt das Detektorsignal, bei Peptiden meist die UV-Absorption bei 214 oder 220 Nanometern. In diesem Wellenlängenbereich absorbiert die Peptidbindung selbst, sodass praktisch jede peptidische Komponente sichtbar wird.

Retentionszeit

Jede Substanz verlässt die Trennsäule nach einer charakteristischen Zeit, der Retentionszeit. In der für Peptide üblichen Umkehrphasen-HPLC (meist C18-Säulen) eluieren polare Moleküle früher, hydrophobe später. Die Retentionszeit hängt aber stark von Säule, Gradient und Laufmittel ab. Sie ist daher nur innerhalb derselben Methode vergleichbar und kein Identitätsnachweis. Die Identität bestätigt die Massenspektrometrie.

Peaks und Peakfläche

Ein Peak ist ein Signal, das ansteigt und wieder abfällt. Die Fläche unter dem Peak ist ungefähr proportional zur Menge der Substanz, die bei dieser Wellenlänge absorbiert. Die Software integriert alle Peaks und berechnet:

Reinheit (%) = Fläche des Hauptpeaks ÷ Summe aller Peakflächen × 100

Das ist eine Flächenprozent-Angabe. Sie setzt voraus, dass alle Komponenten ähnlich stark absorbieren – für eng verwandte Fehlsequenzen ist das eine brauchbare Näherung.

Worauf Sie achten sollten

Hauptpeak

Ein scharfer, symmetrischer Hauptpeak spricht für eine gute Trennung. Ein breiter Peak oder eine „Schulter“ kann auf eine nicht aufgetrennte Nebenkomponente hindeuten.

Nebenpeaks

Kleine Peaks vor oder nach dem Hauptpeak sind typisch für synthetische Peptide. Häufige Ursachen sind Fehlsequenzen mit einer fehlenden Aminosäure, verkürzte Ketten, unvollständig entfernte Schutzgruppen oder oxidierte Formen. Ihr Anteil ist in der Reinheitsangabe bereits berücksichtigt.

Basislinie

Eine ruhige, flache Basislinie erleichtert die Integration. Starkes Rauschen oder Drift kann kleine Peaks verdecken.

Frühe Peaks

Ganz am Anfang erscheint oft ein Signal des Injektionsvolumens oder von Gegenionen wie Trifluoressigsäure. Es wird üblicherweise nicht als Verunreinigung gezählt.

Was das Chromatogramm nicht zeigt

• Wasser und Salze sind im UV-Detektor unsichtbar. Eine HPLC-Reinheit von 99 % heißt nicht, dass 99 % der Einwaage Peptid sind.
• Endotoxine werden mit eigenen Tests bestimmt.
• Die Identität ergibt sich erst aus der Masse.

Diese Grenzen erklärt der Artikel Endotoxin- und Wassergehalt.

Gehalt statt Reinheit

Einige Zertifikate, etwa von Janoshik Analytical, geben zusätzlich eine gemessene Menge pro Vial an. Diese Gehaltsbestimmung vergleicht die Peakfläche mit einem Referenzstandard und beantwortet eine andere Frage als die Reinheit: Wie viel Peptid ist tatsächlich im Vial? Beide Werte finden Sie bei uns je Charge im Analytik-Archiv.

Fazit

Ein Chromatogramm lässt sich mit wenigen Grundbegriffen lesen: Retentionszeit, Peakfläche, Hauptpeak, Nebenpeaks und Basislinie. Die Reinheit in Prozent ist ein Flächenverhältnis der UV-sichtbaren Komponenten. Zusammen mit Massenspektrum und Gehaltsangabe ergibt sich ein vollständiges Bild der Charge.